昆虫体内的各种化学物质如何测定

昆虫体内的各种化学物质及其含量如何测定,比如说蛋白质种类及含量、脂肪种类及含量、核酸种类及含量、氨基酸种类及含量等等。请详细说明

比如说蝉幼虫或蝴蝶

 

最佳答案
本回答由提问者推荐

聪生 6级
2010-05-10 回答
根据飞行肌的能量代谢特点,昆虫在飞行过程中对能源底物的利用情况可以分为三大类,即碳水化合物利用型、脂肪利用型以及两者皆能利用的混合型[1]。其中较为重要的依据是将飞行肌中糖类和脂类代谢的关键酶3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH) 和3-羟酰辅酶A脱氢酶(HOAD)的活性进行比较。Beenakkers等[1]通过对数种昆虫的研究认为,飞蝗Locusta migratoria GAPDH与HOAD的比率接近于1.0,属于糖类和脂肪都能利用的混合型;小桕天蛾Philosamia cynthia仅为0.2,主要利用脂肪作为飞行能源;而红头丽蝇Calliphora erythrocephala 及大多数双翅类昆虫这两种酶的比值均大于100,它们主要利用糖类为飞行提供能源。到目前为止,与昆虫飞行肌能量代谢有关的研究已取得较大进展[2~4],但涉及到鳞翅目昆虫的研究相对较少。Gunn等[5]对非洲粘虫Spodoptera exempta不同发育阶段飞行肌糖类及脂类代谢途径中有关酶活性的研究结果表明,非洲粘虫在飞行过程中,糖类及脂类两种能源贮备物质对其飞行都相当重要,在整个生命活动中,糖类为成虫羽化及短时间飞行提供能源,而脂类则在远距离的迁飞活动中起主要作用。
  粘虫Mythimna separata是一种重要的禾谷类害虫,从田间观察及室内的测试结果都发现它具有较强的飞行能力[6~7]。通过电子显微镜对粘虫飞行肌超微结构的研究也发现,它具有较短的肌节,较高的线粒体和横管含量,所有这些都是粘虫蛾具有较强飞行能力的结构特征[8]。对粘虫体内能源物质的积累和动用的初步研究则表明[9],粘虫在羽化后的几天内积累大量的脂肪,飞行初期主要利用糖类提供能量。对吊飞处理后的粘虫蛾能源物质消耗的测定结果和不同来源粘虫蛾体内脂肪含量的分析发现,脂肪是粘虫远距离飞行的主要能源物质[10~11]。为了明确粘虫飞行肌对能源物质的利用情况,并为阐明粘虫的迁飞行为机制提供进一步的实验依据,我们对粘虫蛹及不同日龄粘虫蛾飞行肌中与能量代谢有关的几种关键酶活性进行了测定与比较。 

1 材料与方法

1.1 实验昆虫及样品的采集   实验用昆虫为室内繁殖的第3代粘虫。虫源是1995年4月在江苏南京捕获的越冬代迁入成虫。幼虫用73 cm×74 cm×34 cm 的养虫箱群体饲养,每箱约150 头。饲料为30~40 cm 高的玉米苗。幼虫老熟时,在箱内加入约5 cm厚、含水量10%的土粒供其化蛹和羽化。成虫羽化后单头饲养在直径8.5 cm、高20 cm的塑料圆筒中,用5%的蜂蜜水饲养,每日更换一次。饲养温度24℃,光周期L∶D=12 h∶12 h,环境相对湿度70%左右。   分别取羽化前 6~12 h的蛹(蛹体开始变色)、初羽化及羽化后1、2、3、5、7日龄的粘虫蛾10头(雌、雄各5头),立即用液氮处死并置于液氮中保存备用。 1.2 酶活性及蛋白质含量的测定   将虫体从液氮中取出,去掉头、足、翅及腹部,仅留胸部进行实验。将胸部放入预先冷冻处理过的匀浆器中,加入冰冷的2 mL 0.1mol/L磷酸钾缓冲溶液(pH7.3,其中含2 mmol/L的EDTA),在冰浴中匀浆,然后将制备的匀浆液在4℃条件下以14 000 g冷冻离心10 min,取上清液进行酶活性的测定[5]。   酶活性的测定用国产72-3型分光光度计在25℃条件下进行。具体操作步骤参照Beenakkers(1969)的方法进行[1]。蛋白质含量测定以牛血清蛋白为标准,用Lowry氏法进行[12]。   所获数据经方差分析测定其差异显著性后,再用Duncan's多重比较法进行比较。文中图例的数值均为平均值±标准差(n=5)。

2 结果分析

2.1 与糖酵解有关的几种酶活性的变化   3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)是反映糖酵解水平较具代表性的酶类之一,其活性水平往往代表糖酵解循环的活性高低[13]。粘虫蛹及不同日龄成虫飞行肌GAPDH 活性不同(图1)。初羽化雄蛾的GAPDH活性明显高于蛹后期(P<0.05),到2日龄达到最大值,并显著高于蛹后期及初羽化雄蛾(P<0.05)。3日龄雄蛾的GAPDH活性较2日龄明显下降(P<0.05),但到7日龄时又有所回升。初羽化雌蛾GAPDH活性比蛹后期明显降低(P<0.05),1日龄时升至最高值,2日龄略有下降,之后一直在一定的水平上波动(P>0.05)。粘虫蛾在羽化后的1~2天之内GAPDH活性急剧升高并在7日龄内一直维持在较高活性水平,表明糖酵解在这段时间内可能一直维持在较活跃的状态。

图1 粘虫蛹及不同日龄成虫飞行肌GAPDH的活性 Fig. 1 GAPDH activity in the flight muscles of pupae and adults at different day-ages of M.separata

  3-磷酸甘油脱氢酶(GDH)是昆虫飞行肌中一种较特殊的酶,其作用是维持糖类代谢的高度有氧状态[13]。粘虫雌、雄蛾的GDH活性变化趋势基本一致(图2)。初羽化成虫的GDH活性明显高于蛹后期(P<0.05),其后变化不明显(P>0.05).GDH在成虫羽化后一直保持在较高的活性水平,这为粘虫迅速氧化由糖酵解产生的还原型辅酶Ⅰ(NADH),从而加快糖代谢的速度,也就为保证粘虫飞行肌高速度的有氧代谢提供了必要的生化基础。

图2 粘虫蛹及不同日龄成虫飞行肌GDH的活性 Fig.2 GDH activity in the flight muscles of pupae and adults at different day-ages of M. separata

  乳酸脱氢酶(LDH)是反映动物体无氧代谢能力的一种酶。这种酶活性在蛹后期和成虫期的变化为(图3):雄蛾的LDH活性在蛹后期较低,羽化后急剧升高(P<0.05) ,至2日龄达到最大值,然后随蛾龄的增加而逐渐下降,1~3日龄雄蛾的LDH活性差异不大(P>0.05),但5日龄后LDH的活性明显低于1~3日龄(P<0.05)。雌蛾的LDH活性变化与雄蛾基本相似,即在成虫羽化后其活性迅速升高,并显著高于蛹后期(P<0.05) , 到1日龄达到最大值后虽有所下降,但仍在较高的活性水平上波动(P>0.05)。这些结果表明粘虫飞行肌除了能进行较高的有氧代谢以外,还具有一定的无氧代谢能力。

图3 粘虫蛹及不同日龄成虫飞行肌LDH的活性 Fig. 3 LDH activity in the flight muscles of pupae and adults at different day-ages of M.separata

2.2 脂肪酸β-氧化的关键酶HOAD的活性变化 3-羟酰辅酶A脱氢酶(HOAD)活性是衡量脂肪代谢水平高低的关键酶之一[13],其活性水平比肉毒碱酰基转移酶更能反映昆虫飞行肌动用脂肪的能力[5]。研究结果(图4)显示,蛹后期及初羽化成虫HOAD活性较低,1日龄急剧升高并明显高于蛹后期及初羽化的成虫(P<0.05)。2日龄达到高峰值后随蛾龄的增加而下降,但7日龄粘虫飞行肌HOAD的活性又再次升高。需要指出的是,尽管初羽化成虫的HOAD活性较蛹后期的有所降低,但差异并不显著(P> 0.05)。HOAD的活性因性别不同略有差异。雌蛾2日龄和7日龄的HOAD活性比1日龄和5日龄要高(P<0.05),而雄蛾的从1到7日龄虽有所变化,但差异并不明显(P>0.05)。这些结果表明,成虫羽化1~2天后动用脂肪的能力迅速增强因而具备了远距离迁飞的能力。另外,粘虫羽化后从2日龄到7日龄HOAD的活性一直维持在较高的水平,这对粘虫高效快速地动用脂肪无疑是非常必要的。

图4 粘虫蛹及不同日龄成虫飞行肌HOAD的活性 Fig. 4  HOAD activity in the flight muscles of pupae and adults at different day-ages of M. separata

2.3 三羧酸循环关键酶的活性变化   三羧酸循环是多种能源物质代谢的最终阶段,通过三羧酸循环,底物被彻底氧化,最后经电子传递链释放能量。柠檬酸合成酶(CS)的活性高低是制约该循环运转的关键因素之一。粘虫雌蛾蛹后期及不同日龄成虫飞行肌中CS活性测定结果(图5)显示:初羽化雌蛾的酶活性比蛹后期略有下降 (P>0.05)。1日龄CS的活性高于初羽化成虫(P<0.05),2、3日龄CS的活性仍继续升高,尽管增加的数值并不显著(P>0.05)。5~7日龄CS活性比1~3日龄明显降低(P<0.05),并与蛹后期及初羽化雌蛾的酶活性处于同一水平。而初羽化雄蛾的CS活性明显高于蛹后期(P<0.05)。之后随蛾龄的增加而继续升高,到3日龄达到最高值,此时该酶活性水平明显高于其它日龄(P<0.05),5~7日龄CS活性急剧降低,与初羽化及1日龄酶活性水平相当。虽然CS的活性在飞行肌中因蛾龄的不同有所差别,但如仅从该酶活性的数值来看,在本实验所涉及的日龄范围内与其它几种被测定的酶活性相比较,其活性都较高。由于三羧酸循环在能量代谢中所处的重要地位,较高的CS活性就保证了飞行肌对能量的大量需求。

图5 粘虫蛹及不同日龄成虫飞行肌CS的活性 Fig. 5 CS activity in the flight muscles of pupae and adults at different day-ages of M.separata

2.4 几种酶活性比值的变化   GAPDH∶HOAD、GAPDH∶CS以及HOAD∶CS的比值是衡量昆虫飞行肌能量利用类型的重要指标[1]。从表1可以看出:GAPDH与HOAD的比值在蛹后期为0.6,因此,蛹后期主要是利用脂肪作为能源物质,糖类的动用也占有一定的比例。成虫初羽化时,所利用的能源物质仍以脂肪为主,但糖类的动用比例又有所增加,羽化后1天,二者的比值上升为1.2,此时成虫利用糖的能力比利用脂肪的能力稍强。从2至5日龄GAPDH∶HOAD一直维持在1.0的水平,表明在此期间成虫利用脂肪和糖的能力相当。7日龄成虫的HOAD活性再次超过GAPDH,表明此时成虫更多的动用脂类作为飞行能源。GAPDH∶CS和HOAD∶CS比值的变化与上述推论是一致的:GAPDH∶CS除1日龄高于HOAD∶CS 外,蛹后期及成虫的其它日龄该比值均等于或低于后者(表1),这表明粘虫除了1日龄利用糖的能力强于脂肪以外,在蛹期及其它日龄成虫利用脂肪的能力比利用糖的稍强或者相等。值得一提的是GAPDH∶HOAD的平均值为1.0,表明粘虫飞行肌能源物质的利用属混合型,即糖类和脂类都为其飞行提供能量,这与飞蝗飞行肌对能源物质的利用方式相似[1]

表1 蛹后期及不同日龄粘虫蛾几种酶活性的比值 Table 1 Ratio of enzyme activities in pupal stage and different adult ages of M. separata

日龄(Days) GPADH∶HOAD GAPDH∶CS HOAD∶CS
蛹pupae 0.6 0.5 0.8
成虫adults 0 0.9 0.6 0.7
  1 1.2 1.0 0.8
  2 1.0 0.7 0.8
  3 1.0 0.7 0.7
  5 1.0 0.8 0.8
  7 0.9 0.9 1.1
平均(mean) 1.0 0.7 0.8

3 讨论

  昆虫组织代谢强弱的变化与相关代谢途径的酶活性关系密切,这一点很早就为人们所认可。在昆虫飞行肌的能量供应中,脂肪和糖类被认为是两类主要的能源物质[2,13]。Gunn等对粘虫幼虫体壁肌的酶活性的研究表明幼虫肌肉的能量供应主要来源于脂肪,与糖类代谢有关的酶活性极低[5],本研究所获结果显示,粘虫在羽化前6~12 h的蛹期,糖类的利用可能已占有一定的比率。有研究认为,昆虫在羽化时蛹的蠕动及羽化后成虫的展翅行为和初次飞行活动会导致糖类动用的比例增加[5]。这也许正是粘虫此时糖类代谢的酶活性升高的原因。粘虫羽化时,尽管糖类动用较蛹后期又有所增加,但此时能源物质的利用可能还是以脂肪为主。粘虫羽化后1天内与糖代谢有关的酶活性几乎都已达到最高水平,此时HOAD的活性稍低,表明粘虫在羽化后的1天之内主要利用糖类作为飞行能源。粘虫此时主要是进行短时间和短距离的取食补充营养的活动。非洲粘虫在短时间飞行时也主要利用糖作为能源[5]。在成虫羽化2 天后,粘虫HOAD的活性一直较高,说明脂类代谢在此期间飞行中的重要作用。从不同日龄的综合结果来看,粘虫飞行肌的GAPDH ∶ HOAD的值为1.0,对能源物质的利用属于混合型。   一些对粘虫迁飞过程中能源物质消耗的研究认为,粘虫长时间飞行主要利用脂肪作飞行能源[10~11]。但Van Handel等[14]对亚热带粘虫Prodenia eridiana的研究结果表明,这种昆虫能直接利用取食所获得的糖类而无须将其转化为脂肪作为能源底物。而飞蝗的飞行肌在利用甘油酯时,所产生的甘油可由脂肪体中的甘油激酶转变为海藻糖进入糖酵解循环[15]。这种代谢机制在非洲粘虫中也可能存在[5]。现有的研究结果显示,粘虫在飞行初期主要动用糖类作为飞行能源,同样它也能直接利用肠道中的糖类为飞行提供能源[9]。Van der Horst 等使用14C标记海藻糖的方法,证明飞蝗在持续飞行期间能继续利用糖类提供约1/4的能源[16]。粘虫在持续飞行阶段是否利用糖类作为飞行的能源补充还未见报道。从本实验中有关糖酵解酶活性的结果来看,粘虫除在飞行初期主要利用糖类以外,在持续飞行阶段糖类代谢也可能起着相当重要的作用,虽然从贮备的数量上来说糖类不可能作为远距离飞行的主要能源底物,但从其取食补充营养的习性及糖代谢酶类的高活性来推测,糖类在持续飞行阶段也是一种必要的补充能源。   值得一提的是,本研究所测定的5种酶活性几乎都存在雄蛾稍高于雌蛾的趋势,这种现象在CS中表现得更加明显。迁徙蚱蜢Melanoplus sanguinipes雌雄个体飞行相同时间,雄性个体消耗的能源物质远高于雌性个体[17]。粘虫飞行初期雄蛾动用海藻糖的比例要比雌蛾大得多[9],而在适宜的温、湿度条件下,飞行同样的时间雄蛾消耗的能源物质也比雌蛾多,这种性别差异导致的能源物质利用率的不同原因可能正是由于不同性别昆虫酶活性的差异所致。至于其中更深层次的生理机制尚有待于进一步的研究。   综合以上研究结果,我们认为,在室内饲养条件下,粘虫飞行肌的能量代谢有以下特点:(1)不同发育阶段的粘虫利用不同能源物质的比例有所不同:在蛹后期粘虫动用糖类的比例增加,但还是以利用脂肪的比例稍大;1日龄动用糖类的比例继续增大;2日龄时脂肪动用增加,这1日龄粘虫飞行肌中糖酵解及脂肪酸β-氧化都已较高,看来已经具备远距离的飞行能力。在2~5日龄这段时间内,飞行肌的糖酵解与β-氧化能力相当;7日脂肪为飞行提供的能源稍多于糖类。(2)粘虫飞行肌的能量代谢属于混合型,它既能利用脂肪又能利用糖类作为飞行能源,尽管粘虫体内糖类的贮备比脂肪低得多,但糖酵解循环在粘虫蛾的飞行中仍然起着相当重要的作用。

*